在上一篇软文中，我们重点学习了对于AAV在脊髓中的注射方式。简单回顾一下，主要的就是三种：除了常见的尾静脉注射之外，如果想要感染整根脊髓我们要用鞘内注射；如果我们想要实现局部的感染那么就要采用髓内注射的方式；除此之外，侧脑室注射也有部分文献会采用这种方式但是大多是观察脑部的神经元，脊髓内的神经元的感染情况作为一个对于中枢整体的检测的指标。今天小编将继续带大家学习AAV在脊髓中的靶向策略，侧重于对于不同的细胞我们应该选择什么启动子以及搭配什么血清型。选择什么样的血清型和启动子取决于我们要感染的目的细胞。所以我们首先要知道脊髓中的大概细胞类型。脊髓作为中枢神经系统的重要组成成分，主要的细胞类型是神经元和胶质细胞。胶质细胞又分为星型胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞[1]。针对不同的类型，我们需要采取不同的感染策略。接下来小编将会就使用了我们的病毒的客户文献进行相关的分析。
首先是神经元细胞，这篇文献[2]中，作者主要是研究TFE3对于脊髓损伤（SCI）的影响。结果表明在SCI中，自噬会导致ER应激，增强ROS的产生。并且发现TFE3和ROS的水平呈反比。最后作者证明了SCI后TFE3的激活部分由AMPK-mTOR和AMPK-SKP2-CARM1信号传导调节。表明TFE3是ROS介导的SCI后自噬功能障碍的重要调节因子，并且TFE3可作为开发SCI治疗方法的有希望的靶标。
在文章中，作者利用AAV-TFE3 shRNA对目的基因实现了干扰表达的效果，通过脊髓原位注射的方式靶向脊髓内的神经元。在这里因为是干扰AAV，作者采用了组成型的U6启动子+AAV9的构建方式。注射的滴度和用量分别为2.26E+13vg/ml,2μl。结果表明在SCI模型鼠中加了TEF3 shRNA的小鼠的神经元中p62的密度显著增强，解释了部分机制。
接下来这篇文献依然是靶向神经元的相关文献[3]，这里采用的是鞘内注射的方式。这篇文献针对脊髓背角神经元和疼痛之间的关系进行了研究。结果表明在db/db的小鼠脊髓背角中，SIRT1表达降低会伴随着结构突触可塑性的增强。通过SIRT1的激动剂SRT1720上调SIRT1可以缓解疼痛行为。通过对SIRT1进行干预，证明STIR1可以通过调节脊髓背角神经元的突触可塑性来影响神经疼痛。
在这篇文章中，作者将AAV-Cre-EGFP鞘内注射到SIRT1flox/flox小鼠中，作者采用了hSyn+AAV9的构建方式，靶向到脊髓的神经元。注射滴度和体积分别为4.7E+10vg，10μl。结果表明STRI1的敲除会诱导疼痛行为并且增强脊髓背角神经元的突触可塑性。
对于星型胶质细胞而言，血清型和启动子比较特殊一点。接下来的这篇文献[4]靶向的就是脊髓的星胶，采用的是髓内多位点注射的方式，注射滴度和体积分别为4E+9 vg/位点,1μl，共4个位点。在这篇文献中，作者比较了AAV血清型的转导效率。并且验证了GfaABC1D启动子的靶向性。结果表明GfaABC1D+AAV5的方案能够最好的达到星型胶质细胞的靶向性。
在靶向少突胶质细胞的AAV注射上，下面这篇文献[5]采用的是吉凯基因的AAV9搭配广谱性的CMV，双侧髓内注射的方式，滴度和体积分别为1.04 E+13vg/ml，0.5μl来实现骨形态发生蛋白（BMP7）的过表达。BMP7可减少神经元的丢失，诱导轴突再生。研究表明γ氨基丁酸在诱导SCI大鼠的少突胶质细胞的生成中发挥了重要的作用，可能与BMP7在少突胶质细胞中的上调有关。作者通过用AAV过表达BMP7，证明了BMP7对TNF-α诱导的少突胶质细胞凋亡的保护作用。
ANXA3在脊髓小胶质细胞中高度表达，并且在骨癌诱发疼痛（BCP）期间上调。但是，小胶质细胞在BCP发生和发展的过程中的作用以及潜在的分子机制不清楚。这篇文献[6]利用AAV-shANXA3在骨癌诱导前进行鞘内注射，进一步进行疼痛行为指标的检测。采用的策略是AAV9+CMV的搭配方式，采用鞘内注射的方式对小胶质细胞进行感染。结果发现，ANXA3在小胶质细胞中表达，并且在BCP期间显著增加。ANXA3的敲除可以逆转疼痛行为但是不能阻止疼痛的发生和发展。
综上，我们可以看到靶向脊髓的细胞可以有神经元特异性的启动子hSyn，广谱性的启动子CMV，星胶特异性的启动子GFAP，对于小胶质细胞而言也可以用小胶特异性的启动子F4/80，血清型多选用使用最为广泛的9型。下面是对各种细胞进行的相关总结：
|
细胞类型 |
启动子 |
|
神经元 |
hSyn |
|
星型胶质细胞 |
GFAP / GfaABC1D |
|
少突胶质细胞 |
CMV |
|
小胶质细胞 |
CMV / F4/80 |
参考文献…
1.Zhang, Q., et al., Single‐cell analysis reveals dynamic changes of neural cells in developing human spinal cord. EMBO reports, 2021. 22(11).
2. Zhou, K., et al., TFE3, a potential therapeutic target for Spinal Cord Injury via augmenting autophagy flux and alleviating ER stress. Theranostics, 2020. 10(20): p. 9280-9302.
3. Zhang, Z., et al., Sirtuin 1 alleviates diabetic neuropathic pain by regulating synaptic plasticity of spinal dorsal horn neurons. Pain, 2019. 160(5): p. 1082-1092.
4. Griffin, J.M., et al., Astrocyte-selective AAV gene therapy through the endogenous GFAP promoter results in robust transduction in the rat spinal cord following injury. Gene Therapy, 2019. 26(5): p. 198-210.
5. Liu, S., et al., Overexpression of bone morphogenetic protein 7 reduces oligodendrocytes loss and promotes functional recovery after spinal cord injury. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 2021. 25(18): p. 8764-8774.
6. Zhang, Z., et al., Microglial annexin A3 downregulation alleviates bone cancer-induced pain through inhibiting the Hif-1α/vascular endothelial growth factor signaling pathway. Pain, 2020. 161(12): p. 2750-2762.