文章导读
顶尖国际学术期刊《Nature》和《Cell》上相继发表了染色体外环状DNA(extrachromosomal circular DNA，eccDNA)促进肿瘤发生的报道使eccDNA成为了基因组学研究的“明星”分子。云序生物紧跟“潮流”，是国内最早提供eccDNA测序服务并且唯一有10分以上文章发表的环状 DNA 测序（circle-seq）服务平台的公司。近期，云序客户连发两篇eccDNA文章，既包括多组学联合分析类文章（国内首篇，15分！云序circle-seq助力国内首篇10分以上环状DNA研究），又有单纯测序发表的文章（山东大学齐鲁医院田辉教授团队在Annals of TranslationalMedicine期刊上发表了eccDNA表达谱文章）。通过circle-seq等高通量测序技术，作者首次揭示了食管鳞癌中的eccDNA表达谱，并探究了eccDNA在食管鳞癌中的潜在机制，为食管鳞癌的临床诊断、治疗等提供了进一步的见解。仅通过测序数据分析，加上qPCR和Sanger测序验证，就可以在3-6个月内短、平、快发表文章！
发表日期：2021年9月9日
样本数量：癌组织 vs癌旁组织（3 vs 3）
研究方法: 环状 DNA 测序（circle-seq）、环状DNA Sanger测序
文章链接：Extrachromosomal circular DNAs are commonand functional in esophageal squamous cell carcinoma
技术路线
研究背景
食管鳞癌是癌症相关死亡的主要原因。食道癌在癌症的发病率排名第七，在世界范围内癌症相关的死亡率第六。迄今为止，食管鳞癌高发病率和预后差的分子机制尚未完全阐明。虽然最近的研究已经证明了eccDNA在各种肿瘤中的存在，但迄今为止，还没有探究eccDNA在食管鳞癌中的分布和功能。最近，高通量测序表明，在母体和胎儿血浆中eccDNA的大小分布是不同的。此外，肺癌样本中发现的eccDNA比配对正常组织中的更长，并且肺癌手术切除后血浆中循环eccDNA数量减少。这些研究提示，eccDNA的分布可能与肿瘤细胞谱系和某些恶性肿瘤的形成有关。此外，通过对包括食管鳞癌在内的各种肿瘤类型的泛癌分析，数以万计的携带已知癌症驱动基因的eccDNA被识别出来，不过主要集中在肿瘤细胞系或组织样本上，缺乏食管鳞癌和配对正常食管上皮组织中eccDNA分布模式的比较。
研究内容
（1）食管鳞癌组织中的eccDNA分布作者首先通过circle-seq高通量测序技术检测食管鳞癌和配对正常食管上皮组织中的eccDNA。eccDNA频率在每条染色体中基本相同，但Y染色体的eccDNA频率要低得多。编码基因数量与各染色体上eccDNA分布频率均无相关性。此外，eccDNA在基因组上的分布主要集中在5’UTR和3’UTR，其次是基因上下2kb以及CpG岛上下2kb。eccDNA全长分布范围为33~968842 bp，95.0%(175363/184557)的eccDNA短于3000bp, 86.1%(158850/184557)短于2000 bp。
接下来，作者根据测序结果对eccDNA在食管鳞癌、正常食管上皮组织中的分布进行了比较。维恩图显示，在184557个eccDNA中，有65809个eccDNA仅在食管鳞癌样本中检测到，4520个eccDNA仅在正常食管上皮中检测到，114228个eccDNA两者共有，但两组样本eccDNA的染色体、基因组以及长度分布模式相似。
（3）食管鳞癌和配对正常食管上皮组织之间差异表达的eccDNA鉴定
分析了两组样本的eccDNA分布模式后，作者接着比较了食管鳞癌和正常食管上皮中eccDNA的表达水平差异。共有16031个差异表达的eccDNA（P-value<0.05 ，|LogFC| >1），其中上调10126个，下调5905个；且只有一小部分差异eccDNA（候选功能性eccDNA）在食管鳞癌和正常食管样本中均检测到。这些候选eccDNA可能是食管鳞癌的潜在生物标志物，并可能参与食管鳞癌的发生和发展。其长度分布范围为44~395,264 bp，且它们主要来自5'UTR和3'UTR。经过分析发现这些上调的eccDNA来源于3219个基因，主要是转录和发育调节因子2（AUTS2）基因。下调的eccDNA来自2235个基因，其中LSAMP、CUB和CSMD1和BICD1基因产生的eccDNA最多。
（4） 差异表达eccDNA相关基因的GO和KEGG通路分析
为了探究差异表达eccDNA相关基因的功能，进行了GO和KEGG分析。发现这些基因主要与神经元、GTPase相关活性和细胞骨架等有关。此外，KEGG通路分析显示，差异表达的eccDNA相关基因主要涉及癌症相关通路、促丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路、局灶粘附和Rap1通路。
（5）食管鳞癌样品中eccDNA的验证
作者接着挑选了部分eccDNA进行PCR验证，包括5个上调和下调的指标。其中，5个上调的eccDNA在至少一种肿瘤样本中强烈表达，而在所有正常上皮样本中均为阴性。同时，5个下调的eccdna在所有肿瘤样本和正常上皮样本中均为阴性。为分析其原因，将高通量测序数据与PCR结果进行了比较，发现只有原始表达值高的eccDNA分子能在PCR中检测到。
为探讨eccDNA的产生机制，对每个eccDNA起始和结束位置上游10 bp至下游10 bp的核苷酸组成进行了motif分析。有趣的是，在起始位点和结束位点之间检测到重复的核苷酸模式，这种核苷酸模式可能是导致eccDNA形成的原因。
云序生物eccDNA测序
云序生物是国内最早提供环状DNA测序服务的公司，早在2018年已启动了环状DNA测序技术的开发。2019年，云序率先发布了组织细胞环状 DNA 测序（circle-seq），并成为A&A Bio独家代理（该品牌的环状 DNA 纯化柱被绝大部分环状DNA高分文章采用）。2020年，云序又相继发布了血清血浆环状DNA测序及血清血浆环状DNA甲基化测序服务，均为全国首发，并成为国内环状DNA产品线最全的测序公司。迄今为止，我们已经完成上千例样品的环状DNA测序，积累了丰富的项目经验，样品类型涵盖：组织﹑细胞﹑血清﹑血浆﹑尿液等，物种涵盖：人﹑小鼠﹑大鼠﹑拟南芥﹑果蝇﹑酵母﹑非洲爪蟾等。云序生物eccDNA相关产品
云序生物基于circle-seq的方法，采用多种手段包括柱纯化去除基因组DNA、酶消化去除线性DNA和线粒体DNA、滚环扩增放大信号，高效地纯化和富集环状DNA，再利用NGS测序和生信分析识别环状DNA。结合优化的实验流程，本环状DNA测序服务具有检出率高﹑准确性好等优点。
云序生物eccDNA测序实验示意图
技术优势：
- 使用原装A&A biotechnology纯化柱高效富集环状DNA
- 滚环扩增放大环状DNA信号，提高检出率
- 专业的生信分析：详尽的注释、丰富的图表
针对血清血浆微量样品，云序生物参考卢煜明教授团队开发的方法，酶切去除线性DNA后，利用Tn5转座酶，打开eccDNA环状结构并同时在DN**段两端加上接头，进行建库及测序。Tn5转座酶法效率高，损耗低，实现血液循环系统中微量的环状DNA的检测。并且本产品能保留环状DNA的原始表达量，使得不同环状DNA间的表达量的比较更为准确。
技术优势：
- 减少DNA损失
- 保留原始表达量，不同环状DNA间表达量比较更准确
针对血清血浆样品，云序参考卢煜明教授团队今年研发的方法，酶切去除线性DNA后，利用Tn5转座酶，打开环状DNA环状结构并同时在DN**段两端加上接头，并用酶转化法将未甲基化的C转化为U，进行建库及测序。一次建库测序中同时检测样品中环状DNA及其甲基化位点的信息。
- 一箭双雕：同时检测环状DNA及其甲基化状况，节约样品，性价比高
- 单碱基分辨的环状DNA甲基化分析
针对测序项目中筛选出的环状DNA，云序提供sanger测序服务验证环状结构。其主要目的在于：为用户提供一种低成本的扩大样品量验证手段，节约实验成本。通过设计反向引物进行PCR扩增，将覆盖环状DNA连接位点的扩增产物进行sanger测序，验证连接位点处序列。
5.A&A Biotechnology 环状 DNA 纯化柱
A&A Biotechnology的纯化柱，是绝大部分环状DNA高分文章中所使用的纯化柱。云序生物是该品牌在国内的唯一总代理。
云序生物服务优势
优势一：首家提供环状DNA测序服务和环状DNA甲基化测序的公司。
优势二：环状DNA相关服务产品线最全的公司。
优势三： A&A Biotechnology 总代理，采用原装A&A Bio纯化柱，环状DNA 纯化效果好。
优势四：一站式服务：您只需按照送样要求向云序生物寄送样品，我们就能为您完成从环状DNA 提取，文库制备，上机测序到数据分析整套服务流程。
优势五：严格质控流程：云序生物质控流程严格，层层把关，为客户提供高准确度的结果。
优势六：专业化生物信息分析：云序生物强大生物信息团队，满足客户个性化数据分析要求。
往期eccDNA主题回顾
Nature新发现—斯坦福大学揭示肿瘤细胞内ecDNA新机制！
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