N6-甲基腺苷(m6A)在多种生物过程中能够调节mRNA的稳定性和翻译。但m6A修饰是否会对DNA转录或染色体开放性产生影响并未可知。于2020年1月16日在线发表在Science期刊上，论文标题为“N6-methyladenosine of chromosome-associated regulatory RNA regulates chromatin state and transcription”，打破了遗传指令从DNA到RNA再到蛋白的单向流动固有看法，为基础生物学研究提供了新的思路。在这项研究中，作者发现敲除小鼠胚胎干细胞中m6A甲基化相关酶Mettl3或Ythdc1以m6A依赖的方式通过染色体相关调控RNA（chromosome-associated regulatory RNA， carRNA），增加染色质开放性，并激活转录。这一发现对我们理解人类疾病和药物设计具有重要意义。
影响因子：41.845
文章链接：N6-methyladenosine of chromosome-associated regulatory RNA regulates chromatin state and transcription
研究内容
（1）m6A修饰对核内染色质的开放性及基因转录具有调控作用
作者研究了两个独立的Mettl3 KO mESCs株系(Mettl3−/−−1和Mettl3−/−−2)并分析新转录的RNA水平。相比于野生型WT mESCs，Mettl3 KO mESCs在的新生转录本明显增加(图1A)。作者构建了WT Mettl3或突变体Mettl3的稳定细胞系(图S1A)。Mettl3 KO上新生转录本的转录增加这与WT中相反(图1B)。那么，Mettl3缺失是否会影响染色质的整体状态。通过脱氧核糖核酸酶(DNase I)介导的TUNEL检测发现，与野生型相比，Mettl3 KO mESCs的染色质开放性明显增加。此外，Mettl3 WT株系中逆转了染色质开放性的增加，表明染色质的开放性与m6A修饰相关(图1，C和D)。综上所述，这些数据表明RNA m6A对核内染色质的开放性及基因转录具有调控作用。
（2）Mettl3和Ythdc1 均会影响CarRNA的表达稳定性
通过LC-MS/MS（云序可提供）发现Mettl3 KO中非核糖体染色体相关RNA (caRNAs)的m6A/A比值明显下降（图2A），表明m6A对caRNAs有作用。接下来对Mettl3 KO和WT mESCs中的caRNAs进行m6A-MeRIP-seq（云序可提供），Mettl3 KO后m6A水平整体下降(图2A)。分析了三种具有潜在调控功能的caRNAs：启动子相关RNA (paRNA)，增强子RNA (eRNA)， 转录自可转座元件RNA(重复RNA)。Mettl3 KO mESCs中这些carRNA的m6A水平明显降低(图2B)。将carRNAs分为 m6A修饰组和non-m6A修饰组，发现Mettl3 KO中m6A修饰组的转录丰度上调(图2 C)。上述结果表明，m6A甲基化使这些carRNA表达不稳定。
先前研究发现，Ythdc1与负责某些非编码核RNA降解的复合物NEXT相关，作者假设Ythdc1识别m6A标记的carRNA，并在mESCs中触发其NEXT衰变。研究发现，在Ythdc1 CKO mESCs中发现了更多的基因间的高甲基化峰。这表明Ythdc1与Mettl3类似，主要影响基因间转录的caRNAs。检测了Ythdc1敲除的carRNAs，发现重复RNA的m6明显增加，表明Ythdc1在mESCs中影响重复RNA的稳定性。此外分析发现Mettl3 KO与Ythdc1 KO之间存在明显的负相关，进一步表明Ythdc1促进了这些carRNA的部分衰减。核RNA衰变分析发现三组carRNA在Ythdc1 CKO上的半衰期明显增加（图2D），在Ythdc1 CKO后carRNA中m6A修饰组RNA的半衰期比非m6A修饰组RNA的半衰期更长（图2E）。
（3）carRNA m6A甲基化修饰下调促进染色质开放与基因转录
LINE1是一类逆转录转座子，在重塑染色质结构和调节转录中起重要作用。验证发现L1Md_F（LINE1家族成员）以依赖于m6A的方式受Ythdc1和Mettl3调控。Mettl3 KO增加转录和染色质开放性(图1)，这些变化是否受到carRNA甲基化的调控？作者对新生转录物和全核RNA进行了RNA-seq（云序可提供）和mNET-seq。在Mettl3 KO上转录本整体水平(图3A和B)和转录速率(图3C和D)增加。在Mettl3 KO mESCs中转录上调的基因往往比下调的基因在carRNA上游具有更多的m6A标记(图3，A和B)。而且，carRNA中上游发生m6A修饰的基因比非m6A修饰的基因转录速率更高。表明Mettl3 KO中carRNA m6A甲基化修饰下降，激活了下游基因的转录。Mettl3 KO中所有m6A依赖基因carRNA上游甲基化减少(~6584个基因)，它们的转录速率都提高了(图3 G)，这些基因主要参与转录调控、染色质修饰和干细胞群体维持。因此，carRNA m6A甲基化修饰下调不但促进下游转录，还可能激活与染色质开放相关的基因表达。
super-enhancers与其靶基因的互作受到mESCs中外泌体调控转录本转录的影响。检测发现约80%的 super-enhancers RNA (seRNAs)含有m6A峰(图3H)。Mettl3 KO上seRNAs的m6A甲基化水平降低，m6A修饰的seRNAs与非m6A修饰的seRNAs相比，转录丰度更高(图3I)。Mettl3 KO中m6A水平降低的seRNAs与下游基因转录率升高相关(图3J)；转录速率差异大于1的基因主要参与转录调控、染色质修饰和干细胞维护，与其他carRNAs的结果一致。
（4）m6A调控的carRNA稳定染色质的开放状态，并招募TFs促进转录激活
那么carRNA甲基化改变如何影响染色质状态变化？作者进行了ChIP-seq，观察到在Mettl3 KO上与H3K4me3和H3K27ac结合水平整体升高。此外，在Mettl3 KO mESCs中，上游发生m6A修饰的carRNA与H3K4me3和H3K27ac结合水平较无m6A修饰的carRNA更高(图4A)。这些数据表明，Mettl3 KO mESCs中carRNA上游的稳定可增加活性组蛋白标记的沉积。作者认为carRNAs可以招募蛋白（CBP/EP300和YY1）从而促进染色质开放和激活转录。ChIP-seq（云序可提供）显示EP300和YY1与Mettl3 KO mESCs结合(图4，B和C)，与邻近eRNAs或paRNAs的高丰度相关。此外，EP300和YY1的结合均与附近的carRNA的m6A水平呈负相关(图4，D和E)，Mettl3 KO导致EP300和YY1在m6A缺失区域的结合升高(图4，F和G）。在Mettl3 KO中同时带有m6A修饰的carRNA和与EP300或YY1结合的基因组区域与带有m6A或与EP300或YY1结合的基因组区域，H3K27ac的增加幅度zui大(图4H)。对JARID2（PRC2的一个成分）进行了ChIP-seq，因为RNA转录本可以阻止PRC2的结合，以保持染色质的开放。因此，这些m6A调控的carRNA可以稳定染色质的开放状态，不但通过招募活跃的TFs，还可以在甲基化缺失时排斥抑制因子，如PRC2。
（5）carRNA的m6A甲基化保持carRNA的稳定性和下游基因的转录
LINE1 的升高也可能调节染色质的整体开放性。作者阻断了Mettl3−/−mESCs中LINE1 RNA的表达，观察到染色质开放性总体降低(图4I)。当使用dCas13b-wt FTO gRNA靶向LINE1时，观察到LINE1的m6A水平下降，半衰期增加，染色质开放性增加。然后，将dCas13b-FTO应用于上游含有m6A标记的carRNA的基因。当使用gRNAs和dCas13b-wt FTO靶向carRNAs时，观察到位点特异性甲基化减少，而使用dCas13b-mu FTO或阴性对照则甲基化变化很小(图4J)。此外这些carRNAs的半衰期增加，下游基因转录上调，局部H3K4me3和H3K27ac水平升高(图4J)。上述结果表明carRNA的m6A甲基化保持carRNA的稳定性和下游基因的转录。
总结
在本研究中结合 LC-MS/MS、m6A-meRIP-seq、RNA-seq、ChIP-seq等多项分子手段发现carRNA可以被Mettl3修饰并对后续转录具有调控作用。这些m6A修饰的carRNAs(主要是LINE1重复序列)会被Ythdc1通过NEXT复合物破坏其稳定性。其中m6A作为一个开关，能够影响carRNAs的丰度，从而调节附近的染色质状态和下游转录。m6A甲基化对carRNA的影响不同；m6A在不同细胞中可以稳定修饰carRNAs。在mESCs中，m6A缺失诱导的转录激活伴随着染色质开放性的增加、某些TFs的富集和组蛋白标记的升高，揭示了在carRNA m6A甲基化和染色质状态之间具有直接相关性。研究结果表明，carRNA 的m6A修饰对转录具有额外的调控作用。
云序生物m6A修饰研究五大模块
01 m6A RNA修饰测序
m6A RNA修饰测序（m6A-seq）
对m6A RNA甲基化，目前流行的检测手段为m6A-Seq技术，适用于m6A RNA甲基化谱研究，快速筛选m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多种非编码RNA的m6A测序：
- m6A 全转录组测序（涵盖mRNA，LncRNA，circRNA）
- m6A LncRNA测序（涵盖LncRNA和mRNA）
- m6A Pri-miRNA测序（涵盖Pri-miRNA和mRNA）
- m6A mRNA测序
- m6A miRNA测序
LC-MS/MS检测整体RNA修饰水平
精zhun高效，可以实现一次检测，9类修饰水平检测，一步到位。
比色法
快速检测m6A整体甲基化水平
03 m6A RNA修饰上游酶的筛选
m6A RNA修饰相关酶PCR芯片
寻找上游直接调控m6A RNA甲基化的甲基转移酶。
04 m6A RNA修饰靶基因验证
meRIP-qPCR
云序提供各类不同修饰的meRIP-qPCR服务，可针对mRNA，lncRNA，环状RNA等不同类型的RNA分子进行检测，低通量验证RNA修饰靶基因表达水平。
05机制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
筛选或验证RNA修饰直接靶点，研究RNA修饰靶基因的调控机制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
筛选或验证目标RNA互作基因或蛋白，研究相应的分子调控机制。
5.3 双荧光素酶实验
验证两基因互作，研究相应的分子调控机制。
5.4 ChIP-seq
筛选或验证目标蛋白与DNA互作，研究相应的分子调控机制。
云序生物服务优势
优势一：发表10分以上文章多的m6A RNA甲基化测序服务平台。云序已累计支持客户发表42篇高水平文章，合计影响因子300分+，是国内支持发文多、累计影响因子高的公司。
优势二：至今完成4000+例 m6A测序样本，覆盖医口、农口等各类样本。
优势三：检测mRNA和各类非编码RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。
优势四：提供m6A一站式服务：m6A整体水平检测、m6A测序、MeRIP-qPCR验证、RIP和RNA pull-down。
优势五：率先研发超微量MeRIP测序技术，RNA量低至500ng起。
优势六：国内全zui的RNA修饰测序平台，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙酰化和2'-O-甲基化测序。
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