间质性膀胱炎（IC）是指膀胱疼痛综合征，以强烈的盆腔疼痛和尿路症状为特征，是一种严重的慢性疾病。为了研究免疫在IC膀胱中的作用，四川大学华西医院的研究者们使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）对15名女性IC患者和9名应激性尿失禁对照组的135,091个CD45+免疫细胞进行了测序。并整合scRNA-seq与空间转录组学的结果，于2022年5月20日在Signal Transduct Target Ther发表文章“Integrating single-cell RNA sequencing with spatial transcriptomics reveals immune landscape for interstitial cystitis”。文章发现在IC膀胱中几乎所有免疫亚群都富集在尿路上皮区或于成纤维细胞附近，但在对照膀胱中却出现在尿路上皮和平滑肌细胞周围，这些发现描述了IC的免疫景观，并为IC的病理生理学提供有价值的见解。
发表期刊：Signal Transduct Target Ther
影响因子：38.104
发表时间：2022年5月20日
研究方法：scRNA-seq、空间转录组学
文章链接：Integrating single-cell RNA sequencing with spatial transcriptomics reveals immune landscape for interstitial cystitis
01 IC膀胱中CD45+免疫细胞的单细胞转录谱
为了在 IC 中重现精确的免疫学图景，作者使用了scRNA-seq。相比于计算大量细胞转录水平均值的批量测序方法，scRNA-seq可以体现细胞之间的转录水平异质性（图1a)。膀胱病理特征结果表明，与对照组相比，IC膀胱出现尿路上皮剥脱或解剖丢失、血管生成和免疫细胞浸润等现象(图1b）。对从24个样本中分离出的135,091个CD45+免疫单细胞进行测序分析，经过严格的质量控制后，作者对92,029个高质量的CD45+免疫细胞进行了进一步分析（图1c）。并发现细胞计数与基因之间的相关系数高（R = 0.8995），但细胞计数与线粒体基因之间相关系数较低（R =−0.006）（图1d）。随后用主成分分析（PCA）进行降维，然后采用均匀流形近似和投影（UMAP）方法进行可视化。检测到7种最明显的造血和组织谱系定义基因的细胞类型，包括T细胞：CD3E（51193,55.6%），B细胞：CD79A（20090,21.8%），髓系细胞：LYZ和CST3（14656,15.9%），成纤维细胞：COL1A1和LUM（3764,4%），上皮细胞：KRT19和UPK1B（1096,1.19%），NK细胞：CD56/NCAM1、CD16/ FCGR3A、NKG7（864,0.94%）和内皮细胞：CD31/ PECAM1（366,0.39%）（图1e-h)。
02 T细胞系和B细胞系的逐步聚类发现CD8+T细胞的功能障碍和B细胞的异常激活
为了表征IC组和对照组之间单个T细胞亚群的变化，作者对T细胞进行亚群化，并根据典型T细胞标记物的表达得到9个亚群，包括5簇CD4+ T细胞，3簇CD8+ T细胞簇和1簇NKT细胞（图2a）。随后分析了与细胞簇相关的基因表达情况（图2b），此外，对T细胞亚群比例的分析显示，IC膀胱中Treg细胞显著增加，Th17细胞显著减少（图2c）。对IC组与对照组相比的差异表达基因（DEGs）进行了GO和KEGG的富集分析。结果发现Tregs的DEGs主要富集于mRNA分解代谢过程、病毒受体和局灶性粘附过程（图2d），Th17细胞的DEGs主要富集于经典的炎症信号通路中，如IL- 17信号通路和NF-kappa B信号通路（图2e）。IC组中CD8+T细胞耗竭基因的表达水平相对高于对照组（图2f-g），表明CD8+ T细胞在IC中存在功能障碍。同样的，为了进一步研究B细胞亚群的转录变化，作者将B细胞亚群化，发现6个B细胞亚群（图2h），如图2i所示。对B细胞亚群比例的分析显示，活化的B细胞和usmb显著增加，smb和tbc显著减少（图2j）。IC组与对照组之间的衰老相关基因表达水平无显著性差异（图2k）。B细胞的异常激活和浆细胞的鉴定暗示了IC患者体内可能发生体液免疫反应。随后，作者对IC组和对照组患者的血浆和尿液中的IgA、IgM、IgG、IgG和IgE等免疫球蛋白进行鉴定。结果发现两组患者血浆中所有的免疫球蛋白均无统计学差异，但IC患者尿液中IgE显著升高（图2l），表明IgE可能是IC的尿液生物标志物。
03 髓系细胞簇的分类和注释揭示免疫相关的巨噬细胞
作者描述了髓系细胞的分子和功能上的差异，并在髓系细胞簇中鉴定出了6种细胞亚型（图3a)。对两组细胞亚群比例的分析显示，IC膀胱中髓系细胞多为中性粒细胞（51.20%），而不是肥大细胞（图3b）。与对照组相比，IC组中性粒细胞中DEGs的KEGG分析显示，在抗原加工和呈递以及类风湿关节炎通路中显著富集（图3c）。拟时序分析描述了从CD14+巨噬细胞到m2样巨噬细胞的主流发育轨迹（图3d-e）。在分化过程中，CD14+巨噬细胞中的促炎基因（IL-1β、S100A8和NLRP3）表达上调，但随着时间的推移逐渐下调。同时，在m2样巨噬细胞中，吞噬基因和调控受体（CD163、FOLR2、STAB1、C1QA1和MSR1）逐渐上调（图3f）。与对照组相比，炎症性CD14+巨噬细胞的功能与炎症反应的产生有关，如IL-6的产生和NFkappa B信号通路的调控（图3g）。然而，m2样巨噬细胞主要通过MHCII类分子调节免疫（图3h），其DEGs主要富集在自身免疫性疾病如多发性硬化症和吉兰-巴雷综合征中。（图3i）。此外，作者对CD68、S100A8和CD163进行了免疫荧光染色，来验证CD14+巨噬细胞和m2样巨噬细胞的存在（图3j）。
04 质谱流式检测技术（CyTOF）验证细胞的免疫表型异质性
作者用CyTOF方法对IC患者膀胱内的免疫亚群进行了鉴定，并验证了scRNA-seq结果（图4a）。每个聚类中所选标记物的蛋白水平如图4b所示，并且T-SNE图确定了来自IC患者和对照组的40个集群（图4b-c）。随后捕获CD45+免疫细胞，进行CyTOF分析（图4d），并确定不同的细胞亚群，包括CD4+ T细胞（CD3+CD4+）、CD8+ T细胞（CD3+CD8+）、B细胞（CD19）、巨噬细胞（CD68）、DC细胞（CD11C）、肥大细胞（KIT）和活化细胞（HLA-DR），推测细胞类型与scRNA-seq结果一致（图4e)。与基于scRNA-seq的集群定义一起，这些数据帮助验证和建立了IC膀胱中的细胞免疫细胞图谱。
05 IC的免疫激活网络
为了确定IC组中细胞激活之间的潜在相互作用，作者分析了相应的受体和配体（仅限趋化因子、细胞因子及其受体）的表达模式。相互作用的受体和配体主要分布在内皮细胞、巨噬细胞、cDCs和CD4+ Tem的表面（图5a）。IC组前50对相互作用的免疫激活网络如图5b所示。CX3CL1主要在上皮细胞中表达，而上皮细胞的受体（CX3CR1）在几个下游细胞亚群中表达上调。作者发现两种趋化因子受体（FGFR1和FGFR2）在几乎所有的细胞亚群中都有表达，但它们的配体（FGF2和FGF10）主要在成纤维细胞中表达（图 5c）。这些发现表明上皮细胞和成纤维细胞可能协调IC膀胱中免疫细胞的转移。炎症因子（TNF、IFNG和IL-1β）的高表达也表明在IC膀胱中有强烈的炎症反应（图 5d），此外，一种新发现的趋化因子CCL5在几乎所有类型的细胞中都表达上调。ELISA检测表明尿液中CCL5水平较高，但在血液中没有发现（图5e），这使CCL5成为IC的潜在尿液生物标志物。研究还发现，Treg中IL-10和IL-35的表达降低（图5f），而TGF-β信号通路的表达上调（图5g），表明IC膀胱中Treg存在功能障碍。除参与免疫应答外，IC患者上皮细胞的DEGs在人乳头瘤病毒感染和与病毒蛋白相互作用的细胞因子和细胞因子受体中富集（图5h），在成纤维细胞的富集分析中也得到了类似的结果（图5i）。随后，作者预测了IC膀胱中上皮细胞的前5个转录因子，包括NR2F1、FOXA1、HOXD1、TBX2和OVOL1（图5j），而NR2F1与HIV感染相关。此外，研究还发现Treg、Th17、Act Bs、SMBs、USMBs和中性粒细胞都与病毒感染相关（图5k）。综上所述，作者推断病毒感染可能是导致IC的潜在原因之一。人多瘤病毒-2在IC尿液中检测到的阳性率为95%（19/20），但在对照组的尿液中没有发现（图5l），该结果也为IC的病因学和病理生理机制提供新的线索和理论依据。
06 空间转录组学（ST）证明了IC尿路上皮中免疫细胞的聚集
将来自IC组和对照组的6个膀胱组织样本放置在空间条形码的ST微阵列玻片上（图1a），经H&E染色和亮场成像后，切片观察明显的组织学特征。从IC膀胱的第一张ST图上（图6a），作者观察到这些基因与UMIs之间有很强的相关性（图6b）。并且作者从平滑肌细胞（SMCs）（DES、ACTG2和CNN1）、尿路上皮细胞（KRT19）、肌成纤维细胞（ACTA2）、间质细胞（ISCs）（VIM和KRT13）和肥大细胞（KIT）上检测到了标记基因（图6c）。此外，作者还描述了膀胱壁的完整结构，包括尿路上皮区、固有层和肌肉层（图6d）。而纤维化基因在不同细胞类型中高表达，表明膀胱结构可能发生了严重的纤维化（图6e）。图6g是对照组膀胱的第一张ST图。这些基因与UMIs之间的相关系数为0.98（图6h）。随后，作者从对照组膀胱组织中鉴定出了SMCs、ISCs、成纤维细胞（COL1A2）、肌成纤维细胞和尿路上皮细胞（图6i-j）。发现在对照组的细胞中，纤维化基因的表达水平较低（图6k）。为了确定免疫细胞在IC膀胱中的位置，作者用MIA方法来解释跨组织之间的空间限制性映射，结果发现几乎所有的免疫亚群均在尿路上皮区或IC膀胱成纤维细胞附近富集（图6f），在对照组膀胱的尿路上皮和平滑肌细胞周围富集（图6l），证实了上皮细胞和成纤维细胞在IC的发展中的重要作用。
本文联合scRNA-seq与空间转录组学技术对间质性膀胱炎免疫图谱进行分析，确认了这些免疫细胞亚群的特征，并阐述了它们之间的关系和相互作用。在IC膀胱和对照组膀胱中观察到不同的免疫细胞分布，暗示尿路上皮可能在IC的病因和进展中起着重要作用。尿路上皮层的损伤可导致其渗漏和通透性的增加，是膀胱疾病病理生理学的关键因素。该研究构建的免疫图谱可能为IC的病理生理学提供一定的支持，并为未来该疾病的诊断和治疗奠定基础。
云序生物推出单细胞测序和空间转录组学技术服务，助力您更好地了解生物学过程和疾病的空间定位。
单细胞测序技术亮点优势：
1）一次性获得上万个细胞的高通量单细胞测序数据
2）多细胞比例低至 0.8%/1000 个细胞
3）单个样品可同时检测免疫细胞表面蛋白编码序列与转录组信息
4）细胞表面蛋白与基因表达联合分析可对细胞亚群精细分类
单细胞测序技术原理：
云序生物提供的单细胞测序技术采用微流控技术，将单个细胞包裹在含有磁珠的油滴内，通过磁珠上的单细胞 barcode 实现对每个细胞来源核酸的溯源。
单细胞测序样本要求：
（1）单细胞测序：
组织样品>0.2g，2-8℃ 组织保存液（Miltenyi，货号：130-100-008）运输，36 小时内送达云序生物实验室。
血液样品 2-5mL，2-8℃ EDTA 抗凝管运输，4 小时内送达云序生物实验室。
单细胞悬液，要求细胞量>106个，使用不含二价金属离子和 EDTA 的缓冲体系，2-8℃ 条件下 2 小时内送达云序生物实验室。
注：单细胞测序细胞直径建议小于30μm，切勿超过40μm
由于单细胞测序对采样和运输的要求非常严苛，请您在采样前与云序生物的销售部门确认送样方式，沟通确认组织保存液/采血管/细胞缓冲液的详细信息，填写《单细胞实验预约单》，并在规定的时间内尽快将样品送至云序生物实验室。
（2）单细胞核测序：
组织>0.2g，细胞>106个。
组织液氮速冻，细胞沉淀-80℃保存，干冰包裹运输。
空间转录组学技术亮点优势：
1）通过分析同一组织切片的组织学特征和mRNA空间表达情况，可以发现新的组织生物标志物。
2）通过转录组分析，可以揭示新发现的细胞流行、细胞状态和生物标志物的空间排布。
3）通过于预先设计的靶基因组合，可以验证之前发现的结果，或关注所有与靶基因相关的基因。
4）阐明生物学结构，并了解正常组织和病理组织中细胞之间的空间关系。
5）分析并了解基因表达的空间异质性，等等。
空间转录组学测序技术原理：
在云序生物提供的空间转录组技术服务当中，透化和杂交步骤发生于玻片上的平面捕获区域，其中含有数千个圆点（spot）。在每个圆点中，玻璃基底上覆盖了数以百万计的寡核苷酸序列。这些附着在玻璃基底表面上的寡核苷酸序列末端存在 poly(dT)VN 结构，可以有效捕获含有 poly(A) 尾巴的 mRNA。不同的圆点中的寡核苷酸序列则拥有不同的“条形码”（Barcode）序列，以形成独一无二的位置定位信息。根据这些空间条形码序列，我们可以将 mRNA 测序结果回溯定位到特定的圆点坐标上，从而实现对 mRNA 表达谱信息的准确空间定位。
1.组织切片，获得约 10 um 厚度的切片
2.传统方法染色成像，如 H&E 染色和免疫荧光染色
3.组织透化（Permeabilization），以从细胞中释放 mRNA
4.杂交，以形成位置信息定位
5.建库和测序
6.数据分析和可视化
空间转录组学测序技术样本要求：
新鲜冷冻组织（包埋冷冻同时进行）
1）样品份数：对于同一来源的样品，云序生物建议寄送2份，其中一份用于常规 RNA 提取质检和实际的空间转录组实验，一份留作备用。
2）样品量：每份样品须小于 6.5mm x 6.5mm x 6.5mm，相当于大约一颗绿豆大小。请勿提供过大或过小的样品，因为样品过大将造成制片困难，无法在单一矩形捕获区域中涵盖整个样品切片；样品过小将造成捕获区域的浪费，且可能导致常规 RNA 质检用量不足。
3）样品保存和运输：因新鲜组织运送要求高，建议客户做到冷冻组织-OCT 包埋后干冰运输送样。
影响因子：38.104
发表时间：2022年5月20日
研究方法：scRNA-seq、空间转录组学
文章链接：Integrating single-cell RNA sequencing with spatial transcriptomics reveals immune landscape for interstitial cystitis
技术路线
研究内容
01 IC膀胱中CD45+免疫细胞的单细胞转录谱
为了在 IC 中重现精确的免疫学图景，作者使用了scRNA-seq。相比于计算大量细胞转录水平均值的批量测序方法，scRNA-seq可以体现细胞之间的转录水平异质性（图1a)。膀胱病理特征结果表明，与对照组相比，IC膀胱出现尿路上皮剥脱或解剖丢失、血管生成和免疫细胞浸润等现象(图1b）。对从24个样本中分离出的135,091个CD45+免疫单细胞进行测序分析，经过严格的质量控制后，作者对92,029个高质量的CD45+免疫细胞进行了进一步分析（图1c）。并发现细胞计数与基因之间的相关系数高（R = 0.8995），但细胞计数与线粒体基因之间相关系数较低（R =−0.006）（图1d）。随后用主成分分析（PCA）进行降维，然后采用均匀流形近似和投影（UMAP）方法进行可视化。检测到7种最明显的造血和组织谱系定义基因的细胞类型，包括T细胞：CD3E（51193,55.6%），B细胞：CD79A（20090,21.8%），髓系细胞：LYZ和CST3（14656,15.9%），成纤维细胞：COL1A1和LUM（3764,4%），上皮细胞：KRT19和UPK1B（1096,1.19%），NK细胞：CD56/NCAM1、CD16/ FCGR3A、NKG7（864,0.94%）和内皮细胞：CD31/ PECAM1（366,0.39%）（图1e-h)。
图1.scRNA-seq和空间转录组学的工作流程概述
02 T细胞系和B细胞系的逐步聚类发现CD8+T细胞的功能障碍和B细胞的异常激活
为了表征IC组和对照组之间单个T细胞亚群的变化，作者对T细胞进行亚群化，并根据典型T细胞标记物的表达得到9个亚群，包括5簇CD4+ T细胞，3簇CD8+ T细胞簇和1簇NKT细胞（图2a）。随后分析了与细胞簇相关的基因表达情况（图2b），此外，对T细胞亚群比例的分析显示，IC膀胱中Treg细胞显著增加，Th17细胞显著减少（图2c）。对IC组与对照组相比的差异表达基因（DEGs）进行了GO和KEGG的富集分析。结果发现Tregs的DEGs主要富集于mRNA分解代谢过程、病毒受体和局灶性粘附过程（图2d），Th17细胞的DEGs主要富集于经典的炎症信号通路中，如IL- 17信号通路和NF-kappa B信号通路（图2e）。IC组中CD8+T细胞耗竭基因的表达水平相对高于对照组（图2f-g），表明CD8+ T细胞在IC中存在功能障碍。同样的，为了进一步研究B细胞亚群的转录变化，作者将B细胞亚群化，发现6个B细胞亚群（图2h），如图2i所示。对B细胞亚群比例的分析显示，活化的B细胞和usmb显著增加，smb和tbc显著减少（图2j）。IC组与对照组之间的衰老相关基因表达水平无显著性差异（图2k）。B细胞的异常激活和浆细胞的鉴定暗示了IC患者体内可能发生体液免疫反应。随后，作者对IC组和对照组患者的血浆和尿液中的IgA、IgM、IgG、IgG和IgE等免疫球蛋白进行鉴定。结果发现两组患者血浆中所有的免疫球蛋白均无统计学差异，但IC患者尿液中IgE显著升高（图2l），表明IgE可能是IC的尿液生物标志物。
图2.T细胞和B细胞的聚焦分析
03 髓系细胞簇的分类和注释揭示免疫相关的巨噬细胞
作者描述了髓系细胞的分子和功能上的差异，并在髓系细胞簇中鉴定出了6种细胞亚型（图3a)。对两组细胞亚群比例的分析显示，IC膀胱中髓系细胞多为中性粒细胞（51.20%），而不是肥大细胞（图3b）。与对照组相比，IC组中性粒细胞中DEGs的KEGG分析显示，在抗原加工和呈递以及类风湿关节炎通路中显著富集（图3c）。拟时序分析描述了从CD14+巨噬细胞到m2样巨噬细胞的主流发育轨迹（图3d-e）。在分化过程中，CD14+巨噬细胞中的促炎基因（IL-1β、S100A8和NLRP3）表达上调，但随着时间的推移逐渐下调。同时，在m2样巨噬细胞中，吞噬基因和调控受体（CD163、FOLR2、STAB1、C1QA1和MSR1）逐渐上调（图3f）。与对照组相比，炎症性CD14+巨噬细胞的功能与炎症反应的产生有关，如IL-6的产生和NFkappa B信号通路的调控（图3g）。然而，m2样巨噬细胞主要通过MHCII类分子调节免疫（图3h），其DEGs主要富集在自身免疫性疾病如多发性硬化症和吉兰-巴雷综合征中。（图3i）。此外，作者对CD68、S100A8和CD163进行了免疫荧光染色，来验证CD14+巨噬细胞和m2样巨噬细胞的存在（图3j）。
图3.髓系细胞的聚焦分析
04 质谱流式检测技术（CyTOF）验证细胞的免疫表型异质性
作者用CyTOF方法对IC患者膀胱内的免疫亚群进行了鉴定，并验证了scRNA-seq结果（图4a）。每个聚类中所选标记物的蛋白水平如图4b所示，并且T-SNE图确定了来自IC患者和对照组的40个集群（图4b-c）。随后捕获CD45+免疫细胞，进行CyTOF分析（图4d），并确定不同的细胞亚群，包括CD4+ T细胞（CD3+CD4+）、CD8+ T细胞（CD3+CD8+）、B细胞（CD19）、巨噬细胞（CD68）、DC细胞（CD11C）、肥大细胞（KIT）和活化细胞（HLA-DR），推测细胞类型与scRNA-seq结果一致（图4e)。与基于scRNA-seq的集群定义一起，这些数据帮助验证和建立了IC膀胱中的细胞免疫细胞图谱。
图4.CyTOF验证IC膀胱中免疫细胞的表型异质性
05 IC的免疫激活网络
为了确定IC组中细胞激活之间的潜在相互作用，作者分析了相应的受体和配体（仅限趋化因子、细胞因子及其受体）的表达模式。相互作用的受体和配体主要分布在内皮细胞、巨噬细胞、cDCs和CD4+ Tem的表面（图5a）。IC组前50对相互作用的免疫激活网络如图5b所示。CX3CL1主要在上皮细胞中表达，而上皮细胞的受体（CX3CR1）在几个下游细胞亚群中表达上调。作者发现两种趋化因子受体（FGFR1和FGFR2）在几乎所有的细胞亚群中都有表达，但它们的配体（FGF2和FGF10）主要在成纤维细胞中表达（图 5c）。这些发现表明上皮细胞和成纤维细胞可能协调IC膀胱中免疫细胞的转移。炎症因子（TNF、IFNG和IL-1β）的高表达也表明在IC膀胱中有强烈的炎症反应（图 5d），此外，一种新发现的趋化因子CCL5在几乎所有类型的细胞中都表达上调。ELISA检测表明尿液中CCL5水平较高，但在血液中没有发现（图5e），这使CCL5成为IC的潜在尿液生物标志物。研究还发现，Treg中IL-10和IL-35的表达降低（图5f），而TGF-β信号通路的表达上调（图5g），表明IC膀胱中Treg存在功能障碍。除参与免疫应答外，IC患者上皮细胞的DEGs在人乳头瘤病毒感染和与病毒蛋白相互作用的细胞因子和细胞因子受体中富集（图5h），在成纤维细胞的富集分析中也得到了类似的结果（图5i）。随后，作者预测了IC膀胱中上皮细胞的前5个转录因子，包括NR2F1、FOXA1、HOXD1、TBX2和OVOL1（图5j），而NR2F1与HIV感染相关。此外，研究还发现Treg、Th17、Act Bs、SMBs、USMBs和中性粒细胞都与病毒感染相关（图5k）。综上所述，作者推断病毒感染可能是导致IC的潜在原因之一。人多瘤病毒-2在IC尿液中检测到的阳性率为95%（19/20），但在对照组的尿液中没有发现（图5l），该结果也为IC的病因学和病理生理机制提供新的线索和理论依据。
图5.基于scRNA-seq的cellphone DB分析揭示免疫网络中的串扰现象
06 空间转录组学（ST）证明了IC尿路上皮中免疫细胞的聚集
将来自IC组和对照组的6个膀胱组织样本放置在空间条形码的ST微阵列玻片上（图1a），经H&E染色和亮场成像后，切片观察明显的组织学特征。从IC膀胱的第一张ST图上（图6a），作者观察到这些基因与UMIs之间有很强的相关性（图6b）。并且作者从平滑肌细胞（SMCs）（DES、ACTG2和CNN1）、尿路上皮细胞（KRT19）、肌成纤维细胞（ACTA2）、间质细胞（ISCs）（VIM和KRT13）和肥大细胞（KIT）上检测到了标记基因（图6c）。此外，作者还描述了膀胱壁的完整结构，包括尿路上皮区、固有层和肌肉层（图6d）。而纤维化基因在不同细胞类型中高表达，表明膀胱结构可能发生了严重的纤维化（图6e）。图6g是对照组膀胱的第一张ST图。这些基因与UMIs之间的相关系数为0.98（图6h）。随后，作者从对照组膀胱组织中鉴定出了SMCs、ISCs、成纤维细胞（COL1A2）、肌成纤维细胞和尿路上皮细胞（图6i-j）。发现在对照组的细胞中，纤维化基因的表达水平较低（图6k）。为了确定免疫细胞在IC膀胱中的位置，作者用MIA方法来解释跨组织之间的空间限制性映射，结果发现几乎所有的免疫亚群均在尿路上皮区或IC膀胱成纤维细胞附近富集（图6f），在对照组膀胱的尿路上皮和平滑肌细胞周围富集（图6l），证实了上皮细胞和成纤维细胞在IC的发展中的重要作用。
图6.使用多模态交叉分析（MIA）绘制IC膀胱切片上不同的免疫群体
小 结
本文联合scRNA-seq与空间转录组学技术对间质性膀胱炎免疫图谱进行分析，确认了这些免疫细胞亚群的特征，并阐述了它们之间的关系和相互作用。在IC膀胱和对照组膀胱中观察到不同的免疫细胞分布，暗示尿路上皮可能在IC的病因和进展中起着重要作用。尿路上皮层的损伤可导致其渗漏和通透性的增加，是膀胱疾病病理生理学的关键因素。该研究构建的免疫图谱可能为IC的病理生理学提供一定的支持，并为未来该疾病的诊断和治疗奠定基础。
云序生物单细胞测序和空间转录组学介绍
云序生物推出单细胞测序和空间转录组学技术服务，助力您更好地了解生物学过程和疾病的空间定位。
单细胞测序技术亮点优势：
1）一次性获得上万个细胞的高通量单细胞测序数据
2）多细胞比例低至 0.8%/1000 个细胞
3）单个样品可同时检测免疫细胞表面蛋白编码序列与转录组信息
4）细胞表面蛋白与基因表达联合分析可对细胞亚群精细分类
单细胞测序技术原理：
云序生物提供的单细胞测序技术采用微流控技术，将单个细胞包裹在含有磁珠的油滴内，通过磁珠上的单细胞 barcode 实现对每个细胞来源核酸的溯源。
单细胞测序样本要求：
（1）单细胞测序：
组织样品>0.2g，2-8℃ 组织保存液（Miltenyi，货号：130-100-008）运输，36 小时内送达云序生物实验室。
血液样品 2-5mL，2-8℃ EDTA 抗凝管运输，4 小时内送达云序生物实验室。
单细胞悬液，要求细胞量>106个，使用不含二价金属离子和 EDTA 的缓冲体系，2-8℃ 条件下 2 小时内送达云序生物实验室。
注：单细胞测序细胞直径建议小于30μm，切勿超过40μm
由于单细胞测序对采样和运输的要求非常严苛，请您在采样前与云序生物的销售部门确认送样方式，沟通确认组织保存液/采血管/细胞缓冲液的详细信息，填写《单细胞实验预约单》，并在规定的时间内尽快将样品送至云序生物实验室。
（2）单细胞核测序：
组织>0.2g，细胞>106个。
组织液氮速冻，细胞沉淀-80℃保存，干冰包裹运输。
空间转录组学技术亮点优势：
1）通过分析同一组织切片的组织学特征和mRNA空间表达情况，可以发现新的组织生物标志物。
2）通过转录组分析，可以揭示新发现的细胞流行、细胞状态和生物标志物的空间排布。
3）通过于预先设计的靶基因组合，可以验证之前发现的结果，或关注所有与靶基因相关的基因。
4）阐明生物学结构，并了解正常组织和病理组织中细胞之间的空间关系。
5）分析并了解基因表达的空间异质性，等等。
空间转录组学测序技术原理：
在云序生物提供的空间转录组技术服务当中，透化和杂交步骤发生于玻片上的平面捕获区域，其中含有数千个圆点（spot）。在每个圆点中，玻璃基底上覆盖了数以百万计的寡核苷酸序列。这些附着在玻璃基底表面上的寡核苷酸序列末端存在 poly(dT)VN 结构，可以有效捕获含有 poly(A) 尾巴的 mRNA。不同的圆点中的寡核苷酸序列则拥有不同的“条形码”（Barcode）序列，以形成独一无二的位置定位信息。根据这些空间条形码序列，我们可以将 mRNA 测序结果回溯定位到特定的圆点坐标上，从而实现对 mRNA 表达谱信息的准确空间定位。
1.组织切片，获得约 10 um 厚度的切片
2.传统方法染色成像，如 H&E 染色和免疫荧光染色
3.组织透化（Permeabilization），以从细胞中释放 mRNA
4.杂交，以形成位置信息定位
5.建库和测序
6.数据分析和可视化
空间转录组学测序技术样本要求：
新鲜冷冻组织（包埋冷冻同时进行）
1）样品份数：对于同一来源的样品，云序生物建议寄送2份，其中一份用于常规 RNA 提取质检和实际的空间转录组实验，一份留作备用。
2）样品量：每份样品须小于 6.5mm x 6.5mm x 6.5mm，相当于大约一颗绿豆大小。请勿提供过大或过小的样品，因为样品过大将造成制片困难，无法在单一矩形捕获区域中涵盖整个样品切片；样品过小将造成捕获区域的浪费，且可能导致常规 RNA 质检用量不足。
3）样品保存和运输：因新鲜组织运送要求高，建议客户做到冷冻组织-OCT 包埋后干冰运输送样。
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