当我们开始跑步的时候往往伴随着我们的呼吸的变化，以便我们在新陈代谢需求增加的情况下保持平衡。呼吸的变化通常表现为呼吸频率和呼吸量的增加。但是关于相关的细胞和神经的环路还不是很清楚。今年5月份，法国Julien Bouvier教授在Nature Communication上发表了一篇名为Upregulation of breathing rate during running exercise by central locomotor circuits in mice［1］的文章详细的为我们介绍了运动时和呼吸相关的两条环路。
其中一条通路来源于中脑运动区（MLR），一个保守的运动控制器。通过直接投射到产生呼吸节律的前伯钦格复合体（preBötC）的神经元上。在运动发生之前，触发呼吸频率的适当增加。另一条环路是含有后肢体回路的脊髓的腰部扩大部分。当运动发生时，通过投射到后梯状核（RTN），也能够有力的调节呼吸频率。
实验结果
一、谷氨酸能的CnF神经元投射到preBötC
首先，研究人员研究了小鼠中促进运动的MLR神经元是否和参与呼吸节律的神经元之间是否有接触。研究人员通过在Vglut2Cre成年小鼠中单侧立体注射Cre依赖性AAV-eYFP，追踪CnF神经元的投射。丰富的eYFP阳性纤维在preBötC中检测到，这些投射以同侧为主。（图1c、d、g）。与此相反，在PF呼吸区的投射很少。（图1f）。为了进一步验证CnF神经元靶向前preBötC神经元，作者利用基因限制的双病毒的方法，从解剖学上揭示了前preBötC的假定输入。作者注射了顺行的Cre依赖性狂犬病辅助病毒(HSV-LSL-TVA-oG43)在一侧的preBötC中，然后在对侧的preBötC中注入EnvAΔG狂犬病（Rb）病毒（图1h）。结果表明，Rb病毒在投射的神经元即preBötC神经元中的表达。经过突触的扩散在双侧的CnF和PPN中都能检测到以及对侧的preBötC和NTS都能检测到，只有少数在PF区能够检测到。总的来说，作者通过注射顺行和逆行病毒的方式证明了，Glut+CnF神经元直接与前BötC的候选呼吸节律生成神经元接触，而不是pF区。
CnF谷氨酸神经元与呼吸发生器preBötC相联系
二、谷氨酸能的CnF神经元能够调节呼吸节律的产生
接下来，研究人员测试了谷氨酸能的CnF神经元在功能上对preBötC的影响。作者通过AAV将兴奋性的光敏蛋白ChR2表达在Vglut2Cre成年小鼠的CnF神经元中，并且在注射的部位上植入了一根光纤。并且利用全身测压法对呼吸的周期进行测量。研究人员发现，对Glut+CnF神经元的单侧光刺激引起了异位的吸气爆发，并缩短了呼吸。这种影响在早期呼气的时候提供光脉冲的效果最为突出。（图2c）。接下来对前BötC中表达ChR2的纤维进行光激活。表达的纤维在CnF中注入病毒后，在preBötC中光活化。(图2d）。这导致了类似的相位依赖性的呼吸周期的缩短。这些结果都表明，Glut+CnF神经元投射到preBötC神经元，并且实验验证了preBötC神经元对吸气爆发生成的兴奋性调节。
光激活CnF神经元会影响preBötC呼吸节律的产生
三、谷氨酸能的CnF神经元会协同调节呼吸和运动
为了获得剧烈位移运动中的呼吸参数，研究人员使用了最近开发的膈肌（DiaEMG）的慢性肌电图记录，Vglut2Cre动物被制成在Glut+CnF神经元中表达ChR2。动物被植入EMG，并被放置于一个线性的走廊里，以1s的脉冲频率进行光照。从侧面对动物进行拍摄，使用视频记录他们的位移速度。结果发现，给予CnF神经元15Hz的光刺激可以使动物参与到运动行为中，更高频的光刺激会使动物的运动速度变快。研究人员发现，CnF的光激活和增加的呼吸频率有关。（图3b、c）。并且通过进一步分析20Hz光刺激的时候小鼠的运动状态，可以分成两种运动状态“pre-loco”以及“loco”状态。（图3d）。研究人员发现DiaEMG的振幅在前Loco阶段没有明显的变化，但在后Loco阶段有明显的变化。（图3e、f）。并且在给予15Hz以下的光照时，呼吸的频率会随着光照的频率加快而加快。（图3g、h）。总的来说，这些结果表明：1）Glut+CnF神经元可以在运动前，甚至在没有运动的情况下，上调呼吸频率；2）在CnF诱发的运动过程中，当实际运动时，呼吸频率从静止状态上升到最高水平；3）在 "运动 "阶段，呼吸频率的增加与在 "运动 "阶段呼吸频率的增加与位移速度成正比，以及4）呼吸不与周期性的肢体运动相锁定。
谷氨酸能的CnF神经元能够上调呼吸的频率即使是在运动没有发生的时候
四、脊髓运动环路会投射到PF呼吸区
之后研究人员想要探究这种快速的运动是否和更强的驱动呼吸的中枢有关，这个中枢和锥体的运动环路有关。因此作者在Vglut2 Cre小鼠的腰部脊髓进行了大体积的Cre依赖性AAV-eYFP注射。（图4a）。结果研究人员发现，在preBötC区的投射很少，但是在PF区存在大量投射。通过对PF区进行分层，结果发现主要是在中间的PF区有荧光的表达。为了进一步确定腰椎到PF区是通过突触进行传递的，研究人员在Vglut2 Cre小鼠腰椎部位注射了AAV-DIO Syp-eYFP，在PF区发现了荧光的表达。接着研究人员在野生型的小鼠的腰椎部位先注射了顺行的AAV1-Syn-Cre，之后在PF脑区注射AAV-DIO-eYFP，结果发现PF区存在荧光的表达。已知，PF区不能投射到腰椎部位，所以PF脑区的荧光不是由腰椎部位的AA1顺行传递到PF区的，而是通过顺行突触实现的。即上升的脊柱突触的目标是pF呼吸区。
五、腰椎的运动环路通过RTNPhox2b/Atoh1的神经元调节呼吸频率
为了探究腰椎的运动环路能否功能性的上调呼吸的频率，研究人员使用了体外分离的新生小鼠的脑干/脊髓。使用分体式浴盆对脑干和脊髓进行了独立的药理操作，进一步记录第四颈椎腹侧的呼吸样活动。结果发现加入神经活性物质NMDA和5-HT可以使脊柱区间诱发的呼吸频率明显上升。当把颈椎横断之后，呼吸样的频率增加消失了。之前的结果表明PF呼吸区是脊髓的上升通路的候选目标。接下来通过完全横断PF来消除物理性的呼吸区。加入活性物质之后，呼吸频率并没有明显改变。接着通过将RTN神经元中PHOX2b的突变等位基因时删除之后给予神经活性物质，发现其呼吸频率并没有进一步上升。这些实验的结果都表明脊柱腰椎环路是通过RTN的RTNPhox2b/Atoh1神经元来调节呼吸活动。
药理上激活类似运动的活动会增加体内吸气的频率，这需要TNPhox2b/Atoh1的完整性
六、沉默RTNPhox2b/Atoh1神经元会降低运动时的呼吸频率
对于RTNPhox2b/Atoh1神经元在体内的重要作用，研究人员想要进一步在运动的时候对于呼吸频率的调节。研究人员使用了Phox2b/Atoh1表达才会表达Cre的小鼠的PF脑区注射了Cre依赖的AAV，编码抑制性的DREADD受体hM4Di。结果表明在PF脑区有绿色荧光，即AAV在此表达。之后给予静止和运动的小鼠CNO，结果表明在小鼠静止的时候，CNO给药对小鼠的吸气频率、吸气和呼气的持续时间没有明显的影响。在小鼠运动的时候，给予CNO，会显著降低呼吸的频率。这些结果表明，RTNPhox2b/Atoh1神经元的活动是在跑步运动中调节呼吸频率所必需的。
七、RTNPhox2b/Atoh1神经元可以投射到preBötC呼吸感受器
为了进一步去确定RTNPhox2b/Atoh1神经元是否会影响到主要的吸气发生器preBötC。研究人员在PF脑区注射了Cre依赖的AAV编码的ChR2。通过对preBötC脑区进行免疫荧光的检测发现有荧光的表达。即 RTNPhox2b/Atoh1神经元可以投射到preBötC。并且研究人员进一步通过全身测压仪器发现单边对RTNPhox2b/Atoh1神经元的光刺激可以引起异位的吸气爆发并缩短呼吸周期（图7e、f）。此外，对RTNPhox2b/Atoh1神经元的1秒光刺激导致了刺激期间呼吸频率明显增加，主要是由于Te的减少，甚至在最低的刺激频率下（图7g，h）。在Atoh1FRTCre;Phox2bFlpo动物的pF区注射Cre依赖性AAV编码的eYFP后，在preBötC中检测到eYFP点（图7i, j）。总的来说，这些结果表明，RTNPhox2b/Atoh1神经元可以通过通过直接投射到前BötC来调节呼吸速率。
总 结
长期以来，在运动过程中呼吸过度的假说一直都有，但是对于其中的细胞和环路还不是很清楚。这篇文献主要发现了两个系统，通过这两个系统，和运动有关的中央网络可以使呼吸频率增加。在静止的状态下，在没有从CnF到运动中心模式发生器（lCPG）的运动启动信号的情况下，preBötC驱动基础吸气率。CnF激活导致动物在进行有效的奔跑之前通气量增加。“preoco ”阶段归因于CnF向preBötC发送直接和快速的激活信号（粗线）。CnF信号在到达运动性CPG之前要穿过多个突触（虚线），这可能支持运动性开始的较长延迟。CnF的激活最终导致了跑步的发生，在此期间，通气量进一步增加。这种效应是由于激活的lCPG向pF的呼吸区发出直接的投射，并在一定程度上部分投射到RTN Phox2b/Atoh1神经元，这些神经元反过来接触并激活preBötC (粗线)。
环路的图示
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【参考文献】
［1］Bouvier, Julien., et al., Upregulation of breathing rate during running exercise by central locomotor circuits in mice. Nat Commun,2023.14(1):p.2939.