产品简介

Cell Counting Kit-8简称CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。WST-8属于MTT的升级产品，工作原理为：在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物（formazan）。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450nm波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。CCK-8法应用非常广泛，如药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等。

产品规格

运输与储存

2-8℃干燥避光储存，有效期1年。-20℃干燥避光保存，有效期2年。冰袋运输。

操作注意

1. 建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。
2. 有条件的情况下建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。加入CCK-8试剂时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基液面下加，容易产生气泡，会干扰OD值读数。
3. 白细胞可能需要培养较长时间。
4. 当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1000 个/孔 (100 μL 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2500个/孔 (100 μL 培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。
5. 如果没有450 nm的滤光片，可以使用吸光度在430-490 nm之间的滤光片，但是450 nm滤光片的检测灵敏度最高。
6. 培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。
7. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
8. 本产品仅作科研用途！

操作说明

1. 制作标准曲线（测定细胞具体数量）

a）先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞到培养板内。

b）按比例（例如：1/2比例）依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每个浓度建议3-6个复孔。

c）接种后培养2-4 h使细胞贴壁，然后加CCK-8试剂培养一定时间后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标（X轴），OD值为纵坐标（Y轴）的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（使用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK-8后的培养时间。）

1. 细胞活性检测

a）在96孔板中接种细胞悬液（100 μL/孔）。将培养板放在培养箱中预培养一段时间（37℃，5% CO₂）。

b）向每孔加入10 μL CCK-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。

c）将培养板在培养箱内孵育1-4 h。

d）用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

e）若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24 h内测定，吸光度不会发生变化。

1. 细胞增殖-毒性检测

a）在96孔板中配制100 μL的细胞悬液。将培养板放在培养箱预培养24 h（37℃，5% CO₂）。

b）向培养板加入10 μL不同浓度的待测物质。

c）将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24或48 h）。

d）向每孔加入10 μL CCK-8溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。

e）将培养板在培养箱内孵育1-4 h。

f）用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

g）若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24 h内测定，吸光度不会发生变化。

注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

1. 活力计算

细胞活力*（％）=[A(加药)-A（空白）]/[A（0加药）-A（空白）] ×100
A（加药）：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度
A（空白）：具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度
A（0加药）：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力