2025年诺贝尔生理学或医学奖再次将目光投向了免疫调节领域，获奖成果揭示了调节性T细胞（Regulatory T cells, Treg）在自身免疫及炎症调控中的核心机制，调节性T细胞作为免疫系统的“刹车器”，再次受到科学界的重视。
Treg疗法临床管线
从临床转化来看，Treg在自身免疫、肿瘤免疫以及器官移植等方向进展较多。比如在自身免疫病治疗方面：针对Treg功能缺陷，通过IL-2信号通路激活或细胞移植恢复其活性，已在类风湿关节炎、1型糖尿病临床试验中显示疗效，在炎性驱动小儿自闭症疾病模型治疗等方面取得新进展。在癌症免疫疗法革新方面：肿瘤微环境中过度积累的Treg会抑制抗肿瘤免疫，通过CCR8单抗等药物靶向清除这类细胞可增强PD-1抑制剂疗效，相关联合疗法响应率及患者生存期获得提升。在器官移植排斥防护方面：输注体外扩增的Treg可降低肾移植等排斥反应风险。但是，人源Treg疗法目前尚未获得正式批准成为上市药物，还需要基础理论及临床医药实践的多方面突破[1]。
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体外诱导Treg细胞关键因子
体外产生的Treg细胞被称为诱导性Treg细胞（iTreg），体内天然产生的Treg细胞被称为天然Treg细胞（nTreg)。
IL-2
通过结合CD4+T细胞表面受体IL-2R从而激活下游STAT5信号通路，STAT5激活后，促进Foxp3基因的转录，IL-2信号可以提高Foxp3表达的稳定性和量，防止其被下调或沉默，同时维持已分化Treg的抑制功能。
TGF-β1
Foxp3表达的关键启动因子也是诱导Foxp3表达的直接信号因子。体外诱导iTreg中在TGF-β和IL-2刺激下，初始T细胞即可产生Foxp3+Treg。
体外诱导Treg细胞实验流程[2]
PBMC分离
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1 将抗凝全血与等体积PBS轻轻混匀，以便降低血液粘稠度。 -
2 在50mL离心管中加入密度离心介质（如Ficoll）溶液（体积建议为稀释血的1/2-1/3）。 -
3 倾斜离心管，缓慢地将稀释血液覆盖在密度离心介质上。 -
4 室温条件下，1150×g离心20 min。
注意：操作时应关闭离心刹车功能，将启动速度和停止速度降到最低
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5 取出位于密度离心介质与血浆层之间的含有PBMCs的白色环,将其转移到一个新的50 mL离心管中。
注意：尽量减少吸取血浆和密度离心介质，不要触碰红色的红细胞沉淀。
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6 用PBS补充至50 mL。在室温条件下，450×g离心10 min。
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7 去除上清液，加入50mL RPMI培养基（含10%胎牛血清），并充分重悬。
注意：如果存在细胞团块，通过40 µm细胞滤网过滤细胞。
nTreg分离
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1 配制分离缓冲液：在PBS中加入0.5%（w/v）人血清白蛋白和2 mM EDTA。
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2 重悬并计数PBMCs，在室温条件下，450×g离心10 min。
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3 每1×107个PBMCs加入90 µL分离缓冲液和2 µL CD25磁珠，充分重悬混匀后在4℃孵育15 min。
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4 用PBS补充满至30 mL。在4℃以450×g离心10 min。
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5 准备LS柱：用3 mL分离缓冲液平衡柱，丢弃流出液。
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6 将细胞重悬于3 mL分离缓冲液中。将细胞转移到LS柱上，用新的15 mL离心管收集流出液。
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7 用3 mL分离缓冲液洗柱2次，将收集的流出液储存在4℃以备后续步骤使用。
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8 从磁铁上取下柱。每柱用3 mL分离缓冲液洗脱2次，收集至15 mL离心管中，得到CD25+的nTreg。
注意：如需要可过第二个柱，可进一步提高纯度。
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9 在4℃以450×g离心10 min，丢弃上清。
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10 用15 mL的T细胞培养基洗涤细胞，在4℃以450×g离心10 min，丢弃上清。
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11 将细胞重悬于0.5 mL的T细胞培养基（含100 IU/mL的 IL-2）中。转移细胞至24孔板。再用0.5 mL培养基冲洗离心管，并合并至24孔板。
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12 计数nTregs，用T细胞培养基（含100 IU/mL的IL-2）调整Treg密度至1-2×106 cells/mL。
注意：通常每个白细胞层的产率为1-4 x 106个Tregs。
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13 在37℃、5%CO2条件下孵育nTreg直至使用。
CD4+T细胞分离
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1 将nTreg耗竭的PBMCs合并至50 mL离心管中，用PBS补充满至50 mL。
注意：nTreg耗竭的PBMCs为【nTreg分离】中步骤8-9收集的流出液，用于进行CD4⁺T细胞分离。
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2 在室温下以200×g离心PBMCs 5-10 min，去除上清。用50 mL PBS重悬细胞，重复2次。
注意：PBS洗涤对于去除血小板至关重要，后续负向分离试剂盒无法去除血小板。在此低速离心条件下，血小板会留在上清液中，可在显微镜载玻片上监测血小板去除情况。
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3 用50 mL PBS重悬PBMCs，并进行细胞计数。
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4 在4℃以450×g离心PBMCs 10 min，去除上清，每107个细胞加入40 µl分离缓冲液，重悬细胞。
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5 每107个细胞加入10 µL初始CD4+T细胞生物素抗体混合物。混合后，在4℃孵育10 min。
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6 加入40 mL冷PBS洗涤细胞，在4℃以450×g离心10 min。去除上清，每107个细胞加入80 µL分离缓冲液重悬细胞。
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7 每107个细胞加入20 µL抗生物素微磁珠。充分混合，在4℃孵育15 min。
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8 用冷PBS补充满至50 mL，在4℃以450×g离心10 min。
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9 准备LS磁柱（用3mL 分离缓冲液进行平衡）。为避免磁柱过载，每个磁柱最多用于 2.5×108个PBMC。
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10 去除上清，用3 mL分离缓冲液重悬细胞。将细胞转移至LS柱。收集流出液（含有初始CD4+T细胞），置于15 mL离心管中。
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11 用2 mL分离缓冲液冲洗离心管，转移至柱上。
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12 用3 mL分离缓冲液洗柱3次，每次等待柱停止滴液后再加入新的液体。
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13 收集流出液（含初始CD4+T细胞），在4℃以450×g离心10 min。
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14 去除上清后，用15 mL T细胞培养基洗涤细胞，在室温下以450×g离心10 min，去除上清/
注意：分离缓冲液含有EDTA，会螯合钙离子，从而影响T细胞激活。在进行任何刺激实验之前，需完全移除分离缓冲液，并用15 mL培养基洗涤细胞2次。
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15 用T细胞培养基重悬细胞，调整密度至2-3×106cells/mL。在适当的培养瓶或孔板中于培养箱内过夜静置细胞。
iTreg细胞诱导培养
诱导培养基的准备
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1 准备并预热T细胞培养基，需补充2 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
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2 准备细胞因子、激活抗体和化合物的储备浓度：
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3 在T细胞培养基中配制4倍浓度的预混液（每孔50 µL）。
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4 前一天，在96孔U型培养板中，每孔加入65 µl含5 µg/mL抗CD3抗体的PBS溶液。用铝箔包裹培养板，在4℃过夜孵育。
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5 培养当天，移除孔中的抗CD3抗体溶液。每孔加入200 µL PBS，洗涤2次后备用。
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6 往孔中加入50 µL的抗CD28抗体和IL-2预混液，50 µL 的TGF-β1预混液，50 µL的ATRA预混液。
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7 用200 µl PBS填充所有空孔，包括边缘孔。将培养板在37℃、5%CO2条件下预热。
初始CD4+ T细胞接种培养
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1 将细胞密度调整密度至2.2-2.6×106cells/mL。
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2 将细胞加入准备好的刺激培养板，每孔50 µL细胞（110,000-130,000细胞/孔）。每个孔的总体积现应为200 µL。
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3 将培养板放入37℃、5%CO2培养箱培养。
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4 从第2至3天起，应可见增殖细胞的小簇，随着时间推移，这些小簇会聚集成更大的簇。
iTreg表型分析
qRT-PCR法
提取RNA对Foxp3和一个管家基因（如RPL13A）进行qRT-PCR。同时检测其他Treg标志基因的表达，例如“Treg上调基因”IL2RA、CTLA4、IKZF4，以及“Treg下调”基因IFNG、SATB1。
流式细胞术
通过流式细胞术筛选出CD4+CD25+Foxp3+Treg。
Treg细胞的流式表型[2]
Treg相关产品推荐
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国际标准品测活
高批间一致性
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参考文献
[1]Xuemei Tong ,Bin Li From “Immune Homeostasis” to “Immune Perturbation”- Insights and Perspectives on the 2025 Nobel Prize in Physiology or Medicine[J].中国科学基金,2025,39(4)